Определение уровня вирусной нагрузки методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Объектом исследования является плазма крови ВИЧ-инфицированных пациентов. Кровь отбирается стерильно в специальные системы для забора крови (вакутайнеры, моноветы) с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта. Гепарин ингибирует ПЦР, поэтому для забора крови его не используют (как следствие - результат реакции может быть ложноотрицательный).
Полимеразная цепная реакция является чрезвычайно чувствительным и специфическим методом, который позволяет выявлять геномные последовательности вирусной РНК или провирусной ДНК. Высокая чувствительность метода требует соблюдения определенных условий: обязательно должно присутствовать три отдельных помещения, отличное качество тест-систем, квалифицированный персонал.
Уровень вирусной нагрузки определяют с помощью тест-системы фирмы «Roche» «Amplicor HIV-1 Monitor Test», имеющие две версии (1.0 и 1.5). Версия 1.0 преимущественно обнаруживает суб тип В ВИЧ-1, версия 1.5 обнаруживает все субтипа ВИЧ-1.
Объект исследования: плазма крови в количестве 0,2 - 0,5 мл. Цельную кровь хранят при температуре 2-8 ° С не более 6:00. Плазму получают центрифугированием при 800 - 1600 g в течение 20 мин. при комнатной температуре до проведения анализа плазма может храниться при + 4С до 24 часов. Транспортируют плазму при температуре +4 24 часа, для длительного хранения замораживают при - 200 ° С.
На пробирке обозначают дату, время забора крови и идентификационный код пациента. Динамический диапазон тест-системы (границы значений, в которых исследование проходит корректно) - 400 - 750 000 копий / мл. В случае, если полученное значение ниже 400 копий / мл, результат исследования трактуется как<400 копий / мл при получении значения, которое превышает 750000 копий / мл, результат исследования трактуется как:> 750000 копий / мл (так значится результат анализа в справке).
Следует отметить, что определение уровня вирусной нагрузки с целью назначения антиретровирусной терапии, мониторинга эффективности АРТ был утвержден управлением по продуктам питания и лекарственным препаратам США (FDA) только с использованием тест системы «Amplicor HIV 1 Monitor Test версия 1.5» (фирма Roche ).
Аналогичный подход для количественной оценки содержания РНК ВИЧ был использован фирмой «Амплисенс» (Россия) в создании набора реагентов «ВИЧ-1 Монитор тест».