Статьи по вирусным гепатитам - Статьи по гепатиту С

Методы ИФА и иммунблотинга в диагностике гепатитов

Констатация HCV-инфекции базируется на  выявлении специфических серологических маркеров. Это важно не только для дифференциальной диагностики гепатита С, но  и для суждения о стадии заболевания, прогнозировании его течения, оценки активности процесса и эффективности противовирусной терапии.

Наиболее широко практикуется определение антиHCV антител. Принципиальное значение имеет генодиагностика, основанная на детекции РНК HCV. Недавно появилась возможность обнаружения  циркулирующих HCV антигенов.

 Метод ИФА

Выявление антиHCV антител проводят при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на основе комплекса  структурных и неструктурных вирусных пептидов.  В настоящее время применяются диагностические системы 3го поколения,  которые построены из рекомбинантных и/или синтетических фрагментов структурных и неструктурных HCVбелков (С, NS3, NS4 и NS5). Внедрение диагностикумов 3-го поколения позволило сократить сроки первичного выявления антиHCV при острой инфекции, существенно повысить чувствительность и специфичность реакции (рис 1).

  Рис.1 Детекция маркеров HCV тестами разных поколений

1

Частота выявления анти-HCV среди РНК HCV позитивных образцов крови приближается к 100 %. На фоне хронической инфекции антитела выявляются постоянно,  а после элиминации вируса сохраняются (прежде всего, анти-С) в течение 48 и более лет. Поэтому формальное наличие анти HCV не всегда говорит о присутствии вируса в организме и не позволяет судить об активности процесса. Для суждения о вирусной нагрузке, активности HCV репликации,  риска хронизации, разграничения острого и хронического гепатита, длительности инфекционного процесса и степени поражения печени   предложено использовать  определение спектра антител к различным HCV пептидам, а также наблюдать за их качественной и количественной динамикой. Это дает ориентировочную информацию, которая требует подтверждения другими методами.

Детекция антител  к каждому из HCV антигенов имеет самостоятельное диагностическое значение. Так например известно, что анти core, анти Е и анти NS3 выявляются на самых ранних этапах сероконверсии, анти NS4 и анти NS5, как правило, появляются позднее. По мере развития инфекционного процесса титры выявляемых анти HCV увеличиваются.

Было показано, что наличие в сыворотке анти HCV core является достаточно надежным  маркером вирусной репликации, поскольку имеются данные о том, что  их присутствие коррелирует с наличием в сыворотке специфической м РНК.

Анти НCV core тест может использоваться в качестве подтверждающего теста при тестировании образцов с «неопределенными» результатами. Сыворотки крови, в которых анти НCV core детектируется в  разведении 1:1000 с большой вероятностью содержат вирус и являются реально позитивными. Образцы, являющиеся позитивными в разведении 1:200 и отрицательными в разведении 1:1000, необходимо в дальнейшем исследовать на наличие вирусной РНК. С большой вероятность эти сыворотки можно отнести к реально негативным.  Таким образом, используя предварительный анти HCV core тест можно существенно снизить количество образцов, требующих подтверждения   методом ПЦР.

Есть данные, что у беременных женщин (4 неделя беременности и выше) может быть ложноположительный тест на анти HCV core.

Анти NS3 могут являться самостоятельным диагностическим маркёром острой НCV инфекции. Высокие титры анти NS3 при остром гепатите С свидетельствуют о  значительной вирусной нагрузке, а длительное сохранение их в острой фазе связано с высоким риском хронизации инфекционного процесса.

Выявление анти NS4 и высокие титры этих антител чаще всего свидетельствуют о длительности инфекционного процесса, и, по всей видимости, коррелируют со степенью поражения печени.

Имеются данные, говорящие о том, что выявление антитNS5 в высоких  титрах часто свидетельствует о присутствии вирусной РНК, а в острой стадии является предиктором хронизации инфекционного процесса. Также имеются данные о  том, что в NS5 области вируса гепатита С имеются последовательности, неспецифически реагирующие с антителами в сыворотках крови человека. При помощи синтетических пептидов было проведено эпитопное картирование этой области, и были найдены последовательности, специфически реагирующие с антителами, вырабатываемыми именно к вирусу гепатита С.

Большое значение для клинической практики может иметь выявление анти Е1/Е2. Выявление анти Е в течение 1 месяца от начала заболевания и быстрое последующее снижение  может свидетельствовать об очищении организма от вирусной РНК, определение анти Е при хроническом гепатите С свидетельствует об активной вирусной репликации.

Для многих вирусных заболеваний, таких как гепатит В, гепатит Д, гепатит А, определение антител класса IgM к различным вирусным маркерам является важным диагностическим показателем острой или хронической инфекции. Важность определения антител этого класса при инфекции вируса гепатита С остается не вполне ясной. Разными авторами получены противоречащие друг другу результаты.  Вопреки ожиданиям IgM ответ в острой фазе  гепатита С не следует классическому пути антителообразования: IgM анти HCV могут выявляться одновременно и даже позднее, чем анти HCV класса IgG. Поэтому обнаружение IgM анти HCV  не может быть использовано как маркер острой HCV инфекции. Вместе с тем длительность циркуляции антикор IgM (35 месяцев)  является фактором, прогнозирующим персистентную инфекцию, а их появление  при хроническом гепатите С свидетельствует о реактивации вируса, т.е. об обострении процесса. Этому соответствует корреляция между темпами снижения антикор IgM и эффективностью противовирусной терапии.

Иммунблотинг

Иммунблотинг (англ. «blot»  пятно) основан на дифференцированном определении антител к различным антигенам (С,  NS3, NS4 и NS5),  которые в виде дискретных фракций  («пятен») фиксируются  на  нитроцеллюлозных полосках и после инкубации с исследуемой сывороткой проявляются мечеными антителами так же, как в «обычном» ИФА. Результат считается положительным при выявлении антител к двум и более антигенам.    

Несмотря на высокую специфичность, современные ИФА-системы не гарантированы от гипердиагностики, т.е. от ложноположительных результатов. Для их исключения  также требуется динамическая оценка на основе  индикации анти HCV к дискретным антигенам (подтверждающие, или конфирмативные тесты).

Наряду с ложноположительными возможны и ложноотрицательные результаты, когда анти HCV антитела не удается обнаружить несмотря на присутствие вируса в организме. Известны по меньшей мере три подобных ситуации:

1) начальный период заболевания (серонегативная фаза острого гепатита  фаза «окна»),

2) больные, получающие иммунодепрессанты (они могут  быть  длительно  инфицированы без сероконверсии),

3) заражение некоторыми HCV генотипами (прежде всего  3  и  4).  

В настоящее время  коммерческие тесты для выявления антител к вирусу гепатита С используют в качестве антигенов рекомбинантные белки или синтетические пептиды, созданные на основе аминокислотной последовательности вируса гепатита C 1-го генотипа.  Однако, растет число наблюдений, что такие тесты могут быть недостаточно эффективны для надежной детекции антител при инфицировании вирусом другого генотипа. Так, например, было показано, что антигены, полученные из  NS3 области  HCV 1-го генотипа, в 5 раз более эффективно узнают антитела в сыворотках больных, инфицированных вирусом HCV 1го генотипа, чем в сыворотках больных, инфицированных вирусом 2го или 3го генотипа. Исследования, проведенные L Bassit  (2002)  продемонстрировали неспособность нескольких коммерческих тестов адекватно детектировать антитела к вирусу гепатита С у больных, инфицированных вирусом 1а и 3а типов. Это наблюдение имеет огромное значение как для регионов, где превалируют вирусы других типов, так и для отдельных популяций.

Таким образом, для эффективной диагностики гепатита С  необходим высокочувствительный тест, способный адекватно реагировать с анти-ВГС любого генотипа. 

Кроме прямого изучения структуры РНК, информация о зараженности конкретным генотипом  может быть получена  на основе изучения антител против генотипоспецифических эпитопов, локализованных в NS5, NS4 и С  белках вируса. Перечень серотипируемых вариантов HCV в настоящее время включает генотипы (субтипы) 1a, 1b, 2a, 2b, 3a и 4а. Результаты серотипирования и РНК-типирования совпадают в 50-95% случаев, в зависимости от генотипа. Осуществляется коммерческий выпуск диагностических препаратов для серотипирования в планшетном варианте ИФА и иммуноблоте.